Transformasi genetik in planta: Teknik ringkas penghantaran sistem CRISPR/Cas9 ke dalam sel bagi tujuan pengeditan genom padi

Amin Asyraf Tamizi, Rogayah Sekeli, Nazrul Hisham Nazaruddin, Nurul Hidayah Samsulrizal dan Zarina Zainuddin

Ringkasan
Sebuah protokol transformasi secara in planta untuk penghantaran sistem CRISPR/Cas9 ke dalam sel padi Malaysia (Oryza sativa L. subsp. indica cv. MR 219) telah dibangunkan. Kaedah ini menggunakan benih yang bercambah dengan koleoptil (tunas) yang dipotong sebagai sasaran untuk infiltrasi Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 dan peratus keberkesanan transformasi yang telah dicapai ialah sekitar 9%. Secara ringkas, biji padi yang telah dikupas disterilkan permukaanya dan direndam selama 48 jam, dan seterusnya koleoptil dipotong untuk mendedahkan meristem apikal. Koleoptil yang dipotong kemudian diinokulasi dengan A. tumefaciens yang mengandungi vektor CRISPR/Cas9. Ko-kultivasi dijalankan dalam persekitaran gelap pada suhu 25 °C ± 2 °C selama lima hari, diikuti dengan tempoh tujuh hari untuk proses pengakaran dan aklimatisasi. Plantlet terhasil kemudian dipindahkan ke dalam pasu tanpa lubang yang mengandungi tanah alluvium. Daun padi yang berumur dua bulan seterusnya dijalankan kajian pemilihan higromisin menggunakan larutan yang mengandungi 50 ?g/mL higromisin dan 1 ?g/mL 6-benzylaminopurine (BAP). Langkah ini membolehkan pengenalpastian tumbuhan yang tahan (rintang) kepada higromisin dan dilabel sebagai transforman yang putatif. Transforman tersebut kemudiannya disahkan melalui tindak balas berantai polimerase (PCR) untuk mengesahkan integrasi gen Cas9 bagi padi T0. Protokol ini menawarkan pendekatan yang pantas untuk penyuntingan genom padi, tanpa melalui prosedur kultur tisu.

Teks penuh (2.16MB)